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我們之前碰到過一些客戶,說做PCR實驗總是出現假陽性,明明沒有加模板最后卻擴出了產物。如果這種現象頻頻出現,就要注意一下操作環境了。如果你去百度上搜索“PCR出現假陽性了怎么辦”,下面給出的建議一定會有防止交叉污染這條建議。有人說模板DNA是大分子,溶于去離子水中,怎么會無緣無故跑出來污染環境呢?小編將會一一解釋。
一.PCR實驗室空調通風系統設計及壓力控制
PCR實驗室空調通風系統設計
PCR實驗室沒有嚴格的凈化要求,但為了避免各實驗區之間交叉污染的可能性,應采用全送全排的氣流組織形式。同時,應嚴格控制輸送和排氣的比例,以確保每個試驗區的壓力要求。 1.試劑儲存和準備區
實驗區的主要操作是儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合物的制備。用于標本生產的試劑和材料應直接運輸到該區域,不得通過其他區域.試劑原料必須儲存在該地區,并在該地區制備所需的儲存試劑。
對個區域對氣流壓力的控制沒有嚴格的要求。
2、標本制備區
該地區的主要操作是保存臨床標本和核酸(RNA、DNA)提取、存儲和添加到擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。
該區域的壓力梯度要求為:相對于相鄰區域的正壓,以避免從相鄰區域進入該區域的氣溶膠污染。此外,由于在樣品添加過程中可能會發生氣溶膠污染,因此應避免在該區域不必要的行走.
3.擴大反應混合物的制備和擴大區域
該區域的主要操作是DNA或 cDNA擴大。此外,已制備的DNA合成的模板cDNA(來自樣品制備區) 添加和主反應混合物(來自試劑儲存和制備區) 反應混合物的制備也可在本區進行。PCR在測量中,反應管通常必須在第一輪擴張后打開。因此,巢式擴張具有很高的污染風險,必須在該地區進行第二次樣品添加.
該區域的壓力梯度要求為:相對于相鄰區域的負壓,以避免氣溶膠從該區域泄漏。為了避免氣溶膠造成的污染,應盡量減少在該地區不必要的行走.個別操作如加樣等應在超凈臺進行。
4、擴大產品分析區域
該區域的主要操作是測量擴增片段。如果使用全自動封閉分析儀器進行檢測,則該區域不能設置.
該地區是擴增產物污染的主要來源,因此該地區的壓力梯度要求為:相對于相鄰區域的負壓,以避免擴增產物從該地區擴散到其他地區.
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二.PCR實驗室區域設計
PCR實驗室區域設計
(1)合理設置各實驗區域;
(2)每個實驗區域應有明顯的標記(如醒目的門板或不同的地面顏色等),避免不同實驗區域的設備物品、試劑等混淆。
2、系統設置合理
(1)空調通風系統設置合理,盡量采用全送全排空調系統;
(2)嚴格控制氣流壓力,確保不同實驗區域的不同壓力要求。
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三.pcr實驗室設計布局
PCR實驗室布局
PCR原則上,擴增檢測實驗室分為試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物制備和擴增區和擴增產品分析區四個單獨的工作區。為了避免交叉污染,進入每個工作區域必須嚴格遵循一個方向,即只能從試劑儲存和準備區域進行→標本制備區→反應混合物的制備和擴大區域→擴大產品分析區域。試驗區之間的試劑和樣品傳輸應通過傳輸窗口進行。
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